原位雜交第二天

1.

1）將探針回收，放于－20C保存（通常探針可重復(fù)使用十次左右）。

2）加入50%甲酰胺/2X***T溶液1毫升，60℃，放置30分鐘，重復(fù)一次。

3）置換2X***T1ml，60℃，放置15分鐘。

4）置換0.2X***T1ml，60℃，放置30分鐘，重復(fù)一次。

2.

1）用MABT洗兩次，每次五分鐘，放在搖床輕輕搖動(dòng)。

2）室溫下加1ml 1：2：7溶液，時(shí)間為一小時(shí)。

3）按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶連，4C 冰箱過(guò)夜。

******原位雜交實(shí)驗(yàn)步驟：

       1. 將準(zhǔn)備做原位雜交的樣本常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。

       2. 玻片的處理：一般采用多聚賴(lài)氨酸或APES。

       3. 石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合，室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。

       4. 暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶（1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻），37℃或室溫消化3--30分鐘（視標(biāo)本新舊、厚薄自行調(diào)整）。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。

既要充分保留被測(cè)核酸，（特別是RNA）不被降解，又要盡可能維持原有***或細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

步驟：基本與免1疫***化學(xué)技術(shù)相似，即***要求新鮮和迅速投入固定液。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.0-7.6），水稻原位雜交檢測(cè)技術(shù)服務(wù)，含有1/1000 DEPC。標(biāo)本較大時(shí)用刀片切成厚度不超過(guò)4mm的小塊，固定1小時(shí)即可，較大的標(biāo)本固定不要超過(guò)2小時(shí)。某些***對(duì)過(guò)度固定尤其敏感，如動(dòng)物大腦，固定時(shí)間30-40分鐘，一般不要超過(guò)1小時(shí)。取材過(guò)程中避免手指、唾液和未經(jīng)RNA酶***處理的器具接觸標(biāo)本。冷凍切片以厚5~30um佳，40℃烤箱內(nèi)干燥2小時(shí)后儲(chǔ)存在-80℃超低溫冰箱，在-20℃可保存２～３周，在-70℃可保存數(shù)月之久。